การตรวจวิเคราะห์ระดับไวตามินดีในน้ำนมเปรียบเทียบกับระดับไวตามินดีในเลือดของหญิงช่วงให้นมบุตรด้วยเทคนิค High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Abstract

ในปัจจุบันได้มีแนวคิดการดำเนินโครงการสายใยรักแห่งครอบครัว มุ่งเน้นให้แม่เลี้ยงดูบุตรด้วยนมแม่เพื่อการพัฒนาการและการเจริญเติบโตที่สมบูรณ์ทั้งทางด้านร่างกายและจิตใจของบุตร ทำให้จำนวนของแม่ที่เลี้ยงดูบุตรด้วยนมแม่เพิ่มมากขึ้น ดังนั้นเด็กทารก กลุ่มหญิงตั้งครรภ์และหญิงให้นมบุตรจึงเป็นกลุ่มประชากรที่มีความเสี่ยงต่อการเกิดภาวะขาดไวตามินดี ซึ่งเป็นกลุ่มที่ควรเฝ้าระวัง ติดตาม และประเมินภาวการณ์ขาดไวตามินดีอย่างใกล้ชิด แต่อย่างไรก็ตามข้อมูลในเรื่องระดับไวตามินดีที่เหมาะสมและความสัมพันธ์ของระดับไวตามินดีในร่างกายและน้ำนมของหญิงในช่วงให้นมบุตรยังมีไม่เพียงพอ นอกจากนั้นการตรวจวิเคราะห์ระดับไวตามินดีในน้ำนมยังมีความยุ่งยาก และราคาแพง ดังนั้นงานวิจัยนี้จึงมีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ของระดับไวตามินดีในเลือดและระดับไวตามินดีในน้ำนมของหญิงช่วงให้นมบุตร และมีจุดมุ่งหมายเพื่อจะพัฒนาวิธีการตรวจวิเคราะห์ไวตามินดีในน้ำนมด้วยเทคนิค HPLC ให้มีความความถูกต้อง แม่นยำ และสามารถนำไปประยุกต์ใช้ทางคลินิกได้ จากการศึกษาพบว่า สภาวะที่เหมาะสมในการเตรียมตัวอย่างสำหรับวิเคราะห์ระดับไวตามินดีในน้ำนมและซีรั่มทำโดยการสกัดด้วยด่าง (โพแทสเซียมไฮดรอไซด์) เข้มข้นใน hexane โดยใช้ retinyl acetate เป็น internal standard (IS) การแยกสารจะใช้คอลัมน์ชนิดคาร์บอน (C-18) และ mobile phase ประกอบด้วยสารผสมของ methanol-deionized water ใช้อัตราการไหลแบบ gradient 1.0 มิลลิลิตรต่อนาที ทำการตรวจวัดด้วยความยาวคลื่น 265 นาโนเมตร ที่อุณหภูมิห้อง 25 องศาเซลเซียส ไวตามินดี (25-(OH)D)สามารถแยกออกจาก IS ได้ที่เวลา 8.56 นาทีและ 9.07 นาทีตามลําดับ ใช้เวลาในการวิเคราะห์รวม 15 นาที ผลการตรวจสอบความถูกต้องน่าเชื่อถือของวิธีวิเคราะห์มีค่าขีดจำกัดของการตรวจพบ (LLOD) เท่ากับ 1.03 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร และมีค่าขีดจำกัดของการตรวจวัดเชิงปริมาณ (LLOQ) เท่ากับ 3.29 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร เส้นกราฟมาตรฐานมีความเป็นเส้นตรง (linearity) เท่ากับ 0.996 ที่ความเข้มข้น 0 - 500 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ความถูกต้อง (accuracy) ของการตรวจวัดไวตามินดีที่ความเข้มข้น 5 25 และ 100 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร ได้ผลอยู่ในช่วง 99.13% – 105.73% ความแม่นยำ (precision) ในการวิเคราะห์ไวตามินดีมีค่า %CV อยู่ในช่วง 1.42 - 5.13 % (within run) และ 3.8 - 5.1% (between run) ดังนั้นวิธีการตรวจวิเคราะห์ที่พัฒนาขึ้นมีความถูกต้องแม่นยำอยู่ในเกณฑ์ที่ยอมรับได้ การประยุกต์วิธีวิเคราะห์ที่พัฒนาได้เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ของระดับไวตามินดีในน้ำนมและซีรั่มของหญิงให้นมบุตรจำนวน 40 ราย พบว่า ระดับไวตามินดีเฉลี่ยในน้ำนมของหญิงให้นมบุตรกลุ่มนี้ (36.99 ± 12.21 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร) มีค่าต่ำกว่าระดับไวตามินดีเฉลี่ยในซีรั่ม (42.58 ± 14.69 นาโนกรัมต่อมิลลิลิตร) อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ และความสัมพันธ์ระหว่างระดับไวตามินดีในน้ำนมและซีรั่มมีความสัมพันธ์อยู่ในระดับปานกลาง (r = 0.501) แสดงให้เห็นว่าการตรวจประเมินระดับไวตามินดีในซีรั่มไม่สามารถใช้เป็นตัวแทนประเมินระดับไวตามินดีในน้ำนมที่ถ่ายทอดจากแม่ไปยังลูกได้ ดังนั้นกลุ่มหญิงให้นมบุตรควรได้รับการตรวจติดตามวัดระดับไวตามินดีในน้ำนมเพื่อประเมินระดับที่จะถ่ายทอดไปยังลูกโดยตรง

Recently, the number of breast feeding mother has been increased in Thailand due to the royal project; Saiyailuk project. However, breast-fed babies take risk to have lower vitamin level than formula babies especially vitamin D. Vitamin D deficiency can cause serious problem such as ricket in children. Therefore, pregnancy woman, breast-feeding women and breast-fed babies are the high risk population of vitamin D deficiency. They are recommended to take vitamin D supplement routinely. However, the relationship and the level between serum vitamin D and maternal vitamin D remain unclear. The aim of this study is to determine the level of vitamin D in serum and maternal milk during lactation. In addition, the accurate and clinical applicable method for detection of vitamin D in maternal milk using high performance liquid chromatography (HPLC) technique has been developed in this study. The sample preparation techniques involved extraction of vitamin D with potassium hydroxide in alkaline condition. Separation was performed on C-18 column and mobile phase consisted of methanol and water in gradient flow rate 1.0 mL/min. UV detector was operated at 265 nm. Vitamin D (25-OH)D was well separated from retinyl acetate (IS) at 25°C with retention time of 8.56 min and 9.07 min, respectively. Total analysis time was 15 min per sample. The method was validated accordingly; LLOD = 1.03 ng/mL and LLOQ = 3.29 ng/mL. The calibration curve was linear over the concentration range of 0-500 ng/mL with r2 = 0.996. Accuracy was 99.13% – 105.73% at concentrations of 5, 25, and 100 ng/mL. precisiony was 1.42 - 5.13 % (within run) and 3.8 - 5.1% (between run) at concentrations of 5, 25, and 100 ng/mL. All accuracy and precision were demonstrated acceptable results. Forty lactation women were included in the study. The mean of vitamin D in maternal milk (36.99 ± 12.21 ng/mL) was demonstrated statistically lower than the mean of vitamin D in maternal serum (42.58 ± 14.69 ng/mL). Results of vitamin D in maternal milk were correlated with vitamin D in maternal serum in medium level (r = 0.501) indicating that serum vitamin D level is not suitable for monitoring vitamin D status in pregnancy or lactation women. Therefore, Lactation women should directly determine the vitamin D level in milk as a good marker for monitoring vitamin D level from mother to child via milk.